Макромолекулы в клетках развивают силы порядка пиконьютонов по
меркам нашего мира это величина, которую можно сравнить с силой
давления лазерной указки на стену. Чтобы изучать внутриклеточные
взаимодействия, нам нужно научиться производить столь желегкие
прикосновения с помощью света или магнитного поля. О том, как
ученые меряются силой с белками и другими молекулами, рассказывает
физик Никита Гудимчук.Лазерные ловушкиСегодня уже создано большое
количество разных методов для измерения. Один из них основан на
методе светового давления, и для него используется лазерная
ловушка, которая представляет собой специальный инструмент для
манипуляции микрообъектами. Лазерную ловушку изобрел Артур Эшкин. В
ловушке имеется сфокусированный луч, и в его фокус затягиваются
диэлектрические объекты и маленькие частицы: микросферы, шарики или
бактерии размером от долей микрометра до нескольких
микрометров.Суть метода заключается в преломлении лучей этими
частицами.Когда луч проходит через частицу, он отклоняется в
сторону. Луч одновременно является волной и частицей, поэтому,
отклоняясь, он передает импульс самой частицы. Лазерный луч имеет
конкретный профиль интенсивности, наиболее мощный в центре и
постепенно ослабевающий по мере продвижения наружу. Самые мощные
лучи, проходящие через центр пучка, отклоняются в сторону и
наиболее сильно отталкивают частицу в центр пучка. Лучи, которые
проходят через частицу периферически, создают отталкивающую силу из
пучка, но эта сила слабее. В итоге равнодействующая сила направлена
в пучок, поэтому он способен удерживать частицы в центре своей оси.
Вдоль распространения луча есть такая же точка интенсивности, в
которой действует идентичный принцип.Благодаря этим осям получается
оптическая ловушка, которая позволяет удерживать объект в
3D-пространстве. Лучи становятся полноценными манипуляторами, с
помощью которых можно передвигать объекты, например бактерии или
специально созданные частицы.Затем наша задача сводится к тому,
чтобы прикрепить к специально созданному шарику молекулу, которая
нас интересует. С помощью лазерной ловушки появляется возможность
смотреть перемещения частицы. Например, если взять биологический
моторный белок, то он будет тратить энергию химического превращения
АТФ (аденозинтрифосфат. Прим. ред.), чтобы совершить работу и
переместить частицу.Для большей информативности результатов
необходимо дополнительно измерить количество силы, которую
прилагает биологическая молекула. Чтобы это сделать, нужно
совершить калибровку лазерной ловушки использовать эталонный сигнал
силы. Для этого берут микросферу и начинают ее перемещать с
известной скоростью в вязкой жидкости. Изначально размер микросферы
и скорость известны, поэтому легко вычисляется вязкая сила, по
которой калибруется жесткость лазерной ловушки. В итоге получается
небольшой динамометр, который позволяет измерять силы в диапазоне
от 1 до 100 пиконьютонов.Одни из первых молекул, которые
исследовали с помощью лазерной ловушки, моторные белки, в частности
белок кинезин, о котором сегодня много известно. Например,
выяснилось, что кинезин может, передвигаясь по микротрубочкам,
развивать силы 57 пиконьютонов, делая миниатюрные шаги размером 8
нанометров. Существуют другие моторы, которые движутся по актиновым
филаментам (тип цитоскелетных нитей). Такие моторные белки
развивают меньшие силы, чем кинезин. Большие силы развивают
РНК-полимеразы моторы, которые шагают вдоль ДНК, развивая силу
около 20 пиконьютонов.Атомно-силовой микроскопВ очищенных системах,
которые вычленяют из клетки для лучшего контроля, и в самих клетках
складывается ситуация, когда к макромолекулам нужно прилагать силы
больше 100 пиконьютонов. В таком случае выгодным инструментом будет
уже не оптическая ловушка, а атомно-силовой микроскоп. У такого
микроскопа есть миниатюрный гибкий зонд кантилевер. На поверхность
этого зонда светит луч лазера, который отражается и улавливается
фотодетектором, поэтому расположение зонда точно известно. Поэтому
при правильной калибровке изгибной жесткости зонда по его
отклонениям можно судить о силе, прилагаемой к молекуле.С помощью
атомно-силового микроскопа можно развивать силы порядка
наноньютонов. Такой метод позволяет разворачивать молекулы белков
или ДНК. При атомно-силовом методе возможно совершать действия,
которые подразумевают большие силы, чем при нековалентном или
фермент-субстратном взаимодействии.Магнитные ловушкиВ некоторых
случаях, для аналогичных измерений выгоднее применить другой
принцип магнитные ловушки. Такая ловушка представляет собой
ферромагнитный объект, который восприимчив к магнитному полю. Если
создать неоднородное магнитное поле, то в нем объект будет
отталкиваться от подложки. Между подложкой и ловушкой можно
растянуть интересующую нас молекулу и изучать ее с помощью
манипуляций, похожих на принципы работы атомно-силового
микроскопа.Изучение силы внутри клеткиВсе три описанных метода
используются только для исследования вычлененных из клетки систем.
Исследования в самой клетке с помощью таких методов не получится
провести. Для измерения силы, существующей внутри клетки, или силы,
которую клетка оказывает на другие клетки, необходимы
дополнительные технологии и способы.Один из таких способов
эластичные наностолбики, которые можно нанести на поверхность
подложки. Если нанести на эти столбики специальный межклеточный
матрикс, то концентрация клетки на подложке с межклеточным
матриксом, под которой находятся столбики, увеличится, поэтому
столбики будут изгибаться под силой клетки. В итоге по наклону
столбиков определяют, в каких областях и какого масштаба силы
развиваются на поверхности клетки.Другой метод, который используют
для исследований сил в клетке, метод FRET-сенсоров. Для него нужны
две чувствительные к свету молекулы. Представим, что первая
молекула флуоресцентная краска, которая начинает светиться зеленым,
когда ее облучают синим светом. Вторая молекула краска, которую
облучают зеленым светом, и она светится красным. Если эти краски
находятся близко друг к другу, то между ними происходит резонансный
перенос энергии безызлучательный переход, который приводит к новому
эффекту. При обычных условиях синий свет дает зеленый свет краски,
но в присутствии смеси этих молекул можно посветить на смесь синим
светом и сразу получить красный, а зеленого совсем не будет, потому
что произошел резонансный переход энергии от одного красителя к
другому.Эффективность перехода энергии сильно зависит от расстояния
между молекулами. Хорошая эффективность перехода означает, что
расстояние лежит в пределах 25 нанометров. Отсутствие перехода
означает, что расстояние сильно больше 25 нанометров. Если переход
не очень эффективен и одновременно видно зеленый и красный свет, то
речь идет о промежуточном состоянии. Эта молекулярная линейка и
используется для исследований.Если между двумя молекулами вставить
пружинку, сделанную из линкера например, аминокислоты пролин и
глицин, то получится подобие зонда, который светится по-разному в
зависимости от его растяжения. Если внедрить такую конструкцию в
клетку, то при даче на вход системы синего цвета будет наблюдаться
зеленый, красный или их смесь. В зависимости от цвета можно понять,
растянут ли линкер и какого масштаба силы развивает эта конструкция
в клетке.